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May 23, 2023

Detección de citomegalovirus (CMV) por PCR digital en muestras de heces para la no

Revista de virología

Virology Journal volumen 19, Número de artículo: 183 (2022) Citar este artículo

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La gastroenteritis por CMV es común en pacientes que reciben trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas y es difícil de distinguir de la enfermedad aguda de injerto contra huésped (aGvHD), que tiene síntomas muy similares pero necesita un tratamiento bastante diferente. La gastroenteritis por CMV es causada por una infección local o reactivación del CMV en el tracto gastrointestinal, mientras que la aGvHD se debe al rechazo inmunológico. El estándar de oro para el diagnóstico de gastroenteritis por CMV y aGvHD es la biopsia gastrointestinal bajo endoscopia, que es invasiva y puede provocar efectos secundarios graves. Las pruebas de muestras de heces con la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) pueden ser una alternativa, mientras que la aplicación en las mediciones de nivel de trazas y la precisión no son lo suficientemente satisfactorias en las investigaciones informadas.

En este estudio, diseñamos un método novedoso que extrajo el ADN libre de células (cfDNA) del sobrenadante fecal para realizar PCR digital (dPCR) para la detección de CMV, analizamos el rendimiento y lo comparamos con el ADN total extraído por el procedimiento actual. .

Veintidós muestras de heces pareadas que utilizaron dos métodos de extracción de ADN demostraron que el método de extracción de cfDNA tenía concentraciones de ADN notablemente más altas y controlaba el número de copias del gen, lo que sugiere que el cfDNA puede ser más informativo y más útil para la detección del segmento de ADN del CMV. El enfoque de dPCR para detectar el segmento de ADN de CMV también muestra una buena linealidad (R2 = 0,997) y una mayor sensibilidad (el límite de detección al 50 % fue de 3,534 copias/μL). Se analizaron 82 muestras de heces de 44 pacientes inmunocomprometidos, la tasa de CMV positivo fue del 28 %, lo que indica que más de una cuarta parte de los síntomas gastrointestinales en estos pacientes pueden ser causados ​​por una infección o reactivación del CMV.

Los resultados combinados sugieren que la detección de CMV por dPCR en cfDNA del sobrenadante de heces es un método poderoso para identificar la gastroenteritis por CMV y ayuda en la toma de decisiones de tratamiento clínico.

Los síntomas gastrointestinales son comunes en pacientes inmunocomprometidos, como los que reciben alo-HSCT, causados ​​muy probablemente por gastroenteritis por CMV [1] y/o aGvHD gastrointestinal [2]. El estándar de oro para el diagnóstico de gastroenteritis por CMV o aGvHD gastrointestinal es la biopsia gastrointestinal, que es un procedimiento invasivo y puede provocar efectos secundarios graves, como hemorragia gastrointestinal o perforación [3, 4]. Los métodos no invasivos, como la detección de segmentos de ADN de CMV mediante qPCR a partir de muestras de heces de pacientes inmunocomprometidos, se consideran una posible sustitución de la biopsia gastrointestinal [5]. Sin embargo, no se ha alcanzado un consenso reconocido sobre el poder diagnóstico de la detección de segmentos de ADN de CMV en muestras de heces para la gastroenteritis por CMV. Varios estudios han revelado que las pruebas de heces basadas en PCR para la detección del segmento de ADN de CMV fueron valiosas en el diagnóstico de gastroenteritis por CMV [6,7,8] o al menos para descartarla [5, 9]. Otros estudios han sugerido que la detección de CMV en las heces era un predictor no calificado de enteritis por CMV [10, 11]. Cabe destacar que el procedimiento de extracción de ADN puede tener un impacto crítico en la detección de CMV en muestras de heces. Primero, las muestras de heces son una matriz compleja con diferentes componentes, que pueden intervenir con la extracción de ADN y la reacción de PCR [12]. En segundo lugar, el procedimiento de extracción de ADN determina si el principal tipo de ADN del producto es ADN total o cfDNA, lo que no se ha considerado completamente con respecto a las diferencias en la detección de segmentos de ADN de CMV.

A diferencia del ADN genómico (gDNA), el cfDNA existe ampliamente en todos los fluidos corporales, como el suero, la orina y el sobrenadante de las heces. En los últimos años se han logrado muchos avances impresionantes en la investigación de cfDNA, especialmente en el campo del diagnóstico precoz no invasivo del cáncer y la detección prenatal [13]. La secuenciación de cfDNA también se utilizó para monitorear la infección y/o el rechazo después del trasplante de pulmón y tuvo buena consistencia con los resultados clínicos [14]. Sin embargo, la detección del segmento de ADN de CMV en cfDNA extraído de muestras de heces para el diagnóstico de infección/reactivación intestinal por CMV no ha sido bien estudiada hasta la fecha.

La PCR cuantitativa, que se considera la técnica estándar de oro para medir los niveles de ADN, tiene algunos inconvenientes, como la dependencia de la curva estándar y la capacidad de rastrear la medición, especialmente en áreas que carecen de estándares y mediciones de nivel de rastreo en enfermedad residual mínima y latencia en infecciones virales. Se demostró que la PCR digital, que es una nueva tecnología disponible comercialmente desde 2011, supera a la qPCR en los ensayos de dilución para ADN sintético [15]. Además, también se informó que el enfoque dPCR funciona mejor en muestras de heces propensas a la inhibición que un ensayo qPCR en la detección de CMV [16].

Aquí, informamos nuestro estudio sobre la detección de CMV basado en diferentes métodos de extracción, ambos de muestras de heces. Además, se evaluó el rendimiento de la dPCR utilizada en la detección de segmentos de ADN de CMV. Mostramos que la detección de CMV en heces cfDNA por dPCR fue sensible y relevante en el diagnóstico de infección intestinal por CMV en pacientes inmunocomprometidos.

En este estudio, los pacientes que recibieron alo-HSCT o terapia con células T del receptor de antígeno quimérico (CAR-T) y que tenían síntomas gastrointestinales, como dolor abdominal y diarrea que duraban más de dos semanas, se inscribieron entre 2017 y 2020. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Tongji, Facultad de Medicina de Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong (TJ-IRB20180809). Se obtuvo el consentimiento informado de los participantes. Las muestras de heces acuosas se colocaron en recipientes estériles y se enviaron al laboratorio inmediatamente una vez recolectadas, se almacenaron a 4 °C por un corto tiempo y luego se procesaron dentro de las 8 h posteriores a la recolección.

Filtramos las muestras acuosas de heces con tela filtrante de malla 300 y centrifugamos las muestras a 3000 rpm durante 10 min, tomamos el sobrenadante y centrifugamos 10 min nuevamente para eliminar el componente tangible. Ambos métodos se iniciaron con 1 ml de sobrenadante fecal. El ADN libre de células y el ADN total se extrajeron con un kit de ácido nucleico circulante QIAamp (número de catálogo 55114; Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.) y el kit QIAamp DNA Stool Mini (número de catálogo 51504; Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.), respectivamente. , siguiendo las instrucciones del fabricante y ambos volúmenes de elución fueron de 25 µL. La concentración de ADN se midió con un fluorómetro Qubit 3.0 (Qubit dsDNA HS Assay Kit; Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) o espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) si la concentración estaba fuera del rango del Fluorómetro Qubit (0–10 ng/µL). Las muestras de ADN se utilizaron inmediatamente en experimentos de prueba o se almacenaron a -20 °C después de la extracción.

Se diseñaron sondas y cebadores dirigidos a la región conservada para IE1 (gen de proteína temprana innata 1) de CMV y el gen de referencia POP4 de la proteína RNasa P nuclear humana utilizando el software Primer Express versión 3.0.1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y sintetizado por Sangon Biotech Company (Shanghai, China). Las secuencias de los cebadores de CMV fueron las siguientes: 5'-GTGATCCATGTGCTTATGACTTTGT-3' directo, 5'-GCCTTGGTCACGGGTGTCT-3' inverso y 5'-FAM-ATCATGTGTTTAGGCCCC-MGB-3' de sonda. Las secuencias de los cebadores de referencia fueron las siguientes: 5'-GGCGGTGGTCCTGAGTACT-3' directo, 5'-AGAGGCCTTTGGCTTTCTTCTT-3' inverso y 5'-VIC-ACCCGCCACAAGC-MGB-3' de sonda. Las longitudes de los amplicones de CMV y POP4 fueron de 64 pb y 68 pb, respectivamente.

El enfoque dPCR se llevó a cabo como se describe anteriormente [17]. Brevemente, una mezcla de reacción compuesta por 10 µL 2× ddPCR Supermix (sin dUTP; Bio–Rad, Hercules, EE. UU.), cebadores (1 µL, 10 µmol/L), sondas marcadas con fluorescencia (2 µL, 2,5 µmol/L), y se cargaron 2 µL de plantilla de ADN (rango de 0,6–66 ng) en un sistema de PCR digital Quantalife QX200 Droplet (Bio–Rad, Hercules, EE. UU.), el volumen total de la mezcla de reacción fue de 20 µL. Se generaron gotas de agua en aceite en cartuchos de ocho pozos utilizando el generador de gotas QX200 y se transfirieron a una placa de polipropileno de 96 pozos, que se selló con papel de aluminio. Luego, la placa se colocó en un termociclador ABI (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Las condiciones fueron las siguientes: 95 °C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 30 s, 60 °C durante 1 min (no más de 2,5 °C/segundo de rampa), con una retención de 10 min a 98 °C y un mantenimiento final a 4 °C. Después de la PCR, los resultados se leyeron con un lector de gotas QX200 y se analizaron en el software QuantaSoft versión 1.7.4 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cada reacción se analizó individualmente y los umbrales se ajustaron manualmente cuando fue necesario y se adaptaron por separado para los canales fluorescentes. Los resultados finales del número de copias en las muestras originales se presentaron como copias/ml para el segmento de ADN de CMV y el gen de referencia de forma predeterminada (archivos adicionales 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7).

La secuencia diana de CMV se conectó al vector plásmido pUC57 para construir un estándar de plásmido para probar la capacidad cuantitativa y el plásmido recombinante se transformó en E. coli DH5α para completar la proliferación. El plásmido recombinante se extrajo y purificó utilizando EndoFree Plasmid Maxi Kit (número de catálogo 12362; Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.), y se cuantificó con espectrofotómetro NanoDrop, luego se calculó el número de copias con concentración conocida, masa molecular y constante de Avogadro. El plásmido recombinante se linealizó mediante las enzimas de restricción HindIII (número de catálogo R0104S; NEB, EE. UU.) y BamHI (número de catálogo R0136S; NEB, EE. UU.), conservando intacta la secuencia diana del CMV en el plásmido linealizado. Se realizaron diluciones en serie de cinco veces a concentraciones que oscilaban entre aproximadamente 10.000 copias/µl y 3,2 copias/µl y se sometieron a dPCR. Cada concentración de estándar se repitió tres veces en las mismas condiciones para determinar la linealidad cuantitativa.

Se recogieron 3 ml de muestras de sangre total anticoaguladas con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y luego se centrifugaron a 3000 r/min durante 5 min para recolectar 100 µl de plasma para la detección de ADN de CMV. Las muestras de plasma se procesaron y el ADN de CMV se analizó de acuerdo con las instrucciones del kit de detección de calificación de fluorescencia PCR HCMV (Daan gene, Guangzhou, China).

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software estadístico R v4.0.5. La prueba de rango con signo de Wilcoxon en muestras pareadas, la prueba exacta de Fisher y la prueba de chi-cuadrado de Pearson se usaron en situaciones específicas según correspondiera.

Para probar si el método de extracción de ADN es importante en la detección de segmentos de ADN de CMV, comparamos las concentraciones de ADN y el número de copias de genes de control entre muestras de heces idénticas usando dos métodos de extracción de ADN. El cfDNA se extrajo con un QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit, que se marcó como Kit 1. El ADN total se extrajo con un QIAamp DNA Stool Mini Kit, que se marcó como Kit 2. Se recogieron veintidós muestras de heces de pacientes con una variedad de enfermedades y estados clínicos. Cada muestra se separó en dos partes con volúmenes iguales y se sometió a extracción de ADN libre y ADN total por separado. Sorprendentemente, con el mismo volumen de elución, la concentración de cfDNA superó significativamente la del ADN total emparejado (Fig. 1A). Luego, detectamos números de copias de genes de control tanto en cfDNA como en ADN total extraído de muestras emparejadas y encontramos que los números de copias de genes de control eran notablemente más altos en cfDNA que en extractos de ADN total (Fig. 1B). Además, el gen de control no se detectó en 3 de los 22 extractos de ADN total, pero no en los extractos de cfDNA. Estos resultados sugieren que el método de extracción de ADN tiene un efecto notable en la eficiencia de extracción de ADN y que el cfDNA puede ser más abundante y más útil para la detección de microorganismos patógenos que el ADN total en muestras especiales, como muestras de heces.

Comparación emparejada entre cfDNA y el ADN total extraído de las mismas muestras de heces utilizando dos kits de extracción distintos. Los puntos representan las concentraciones de cfDNA y ADN total, y las muestras de ADN extraídas de los mismos especímenes están unidas por líneas grises. Los puntos B representan el número de copias del gen de referencia en las muestras de ADN, y las extraídas de las mismas muestras están unidas por líneas grises.

Antes de la aplicación a las muestras clínicas, se realizó un ensayo de validación utilizando un control positivo con segmentos de CMV y POP4 y un control negativo con solo segmentos de POP4 para probar la especificidad de los cebadores y las sondas para detectar el ADN de CMV y el gen de referencia. Tanto el control positivo como el negativo tenían señal POP4, mientras que solo el control positivo tenía señal CMV (Fig. 2). Para probar el rendimiento adicional del enfoque de dPCR en la detección de segmentos de ADN de CMV, establecimos un estándar de segmento de ADN de CMV mediante una dilución en serie de cinco veces del plásmido que contiene el segmento de ADN de CMV desde una concentración de 10 000 copias/μl a 3,2 copias/μl. Como era de esperar, los números de copias medidos del segmento de ADN de CMV estaban bastante cerca de los números de copias predichos (Fig. 3A). El R cuadrado de la regresión lineal de los números de copias medidos fue 0,997. El LOD50 (límite de detección al 50%) indica la concentración a la que se pueden detectar la mitad de las muestras positivas. Para determinar el LOD50 del enfoque de dPCR para la detección del segmento de ADN del CMV, primero preparamos una concentración estándar de 80 copias/μL a partir de 10 000 copias/μL mediante una dilución en serie de cinco veces, luego se realizaron diluciones en serie de dos veces para obtener concentraciones que oscilaban entre 40, 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625 y 0,313 copias/μL.

Muestras de control negativo y positivo de detección de segmento de ADN de CMV. Las líneas magenta indican el umbral de fluorescencia establecido para distinguir las gotas positivas y las gotas negativas. Las gotitas grises son gotitas sin señales. Las gotitas verdes son gotitas con una señal positiva para POP4. Las gotitas azules son gotitas con una señal positiva para el ADN de CMV. Las gotitas rojas son gotitas con señales tanto para el ADN de POP4 como para el ADN de CMV. Un control negativo de un donante sano. B Control positivo de un paciente donante ya diagnosticado con infección por CMV

La estimación del rendimiento de la detección de segmentos de ADN de CMV por dPCR. Una comparación del número de copias del segmento de ADN de CMV detectado y el previsto. El eje x muestra el número de copias del segmento de ADN de CMV previsto de los estándares, que se puede estimar por el grado de dilución de la solución sin procesar con una concentración conocida del segmento de ADN de CMV. El eje Y muestra el número exacto de copias del segmento de ADN de CMV detectado de los estándares. Cada triángulo rojo representa una detección y cada grado de dilución corresponde a tres triángulos rojos. La línea verde representa la curva de mejor ajuste. B La probabilidad de detección del segmento de ADN de CMV a bajas concentraciones. El eje x muestra la concentración del segmento de ADN del CMV del plásmido y el eje y muestra la probabilidad de detección. El triángulo rojo representa la probabilidad de detección calculada al dividir el número total de experimentos por el número de experimentos detectados positivamente. La línea verde representa la mejor curva de ajuste no lineal

Cada muestra estándar se analizó 8 veces y se calculó la tasa de detección positiva. Se realizó una regresión no lineal para las tasas positivas a diferentes concentraciones con una aptitud R cuadrada de 0,98 (Fig. 3B). Luego, el LOD50 se calculó en 3,534 copias/μL, y el CMV podría detectarse con más del 50 % de probabilidad cuando la concentración del segmento de ADN del CMV en las muestras estaba por encima de ese valor.

Aplicamos el enfoque dPCR establecido para detectar el segmento de ADN de CMV en muestras de heces de pacientes inmunocomprometidos. Un total de 44 pacientes se inscribieron en nuestro estudio, entre los cuales 33 estaban recibiendo terapia con alo-HSCT, 9 estaban recibiendo terapia con células CAR-T y 2 estaban recibiendo terapia con células CAR-T y alo-HSCT. Once de los pacientes participaron en ensayos clínicos de inmunoterapia secuencial con células CAR-T CD19/22, que se informó recientemente en Blood [18]. Las características clínicas detalladas de los pacientes se muestran en la Tabla 1. Se recolectaron 82 muestras de heces de estos pacientes cuando presentaban dolor abdominal y síntomas de diarrea que no podían controlarse con la aplicación a corto plazo de medicamentos antidiarreicos como la berberina y el polvo de montmorillonita. . Analizamos la tasa de positividad para CMV de muestras de heces de pacientes con diferentes enfermedades primarias, y no se encontraron diferencias significativas (Fig. 4A, p = 0.81 por la prueba exacta de Fisher). De acuerdo con los diferentes métodos de terapia, la tasa de positividad para CMV entre los pacientes que recibieron terapia con células CAR-T o terapia con alo-HSCT tampoco fue significativamente diferente (Fig. 4B, p = 1 por la prueba exacta de Fisher). La tasa positiva total fue del 28 %, lo que indica que más de una cuarta parte de los síntomas gastrointestinales en estos pacientes inmunodeprimidos pueden ser causados ​​por una infección o reactivación del CMV.

El número de muestras CMV positivas y CMV negativas en diferentes pacientes o grupos de muestras. A Las muestras se agrupan por diferentes tipos de enfermedades. Los histogramas exhiben las composiciones de proporciones de muestras positivas y negativas. B Los pacientes se agrupan por el tipo de tratamiento principal, a saber, alo-HSCT o terapia con células CAR-T. Los histogramas muestran el porcentaje de muestras positivas y negativas

El caso 1 (fig. 5A) era un paciente varón de 16 años. Se le diagnosticó leucemia linfoide aguda en febrero de 2018 y recibió alo-HSCT en diciembre de 2018. Once días después de la transfusión de células madre hematopoyéticas, las células madre trasplantadas se implantaron por completo. Dos meses más tarde, de repente sufrió de dolor abdominal y diarrea. Nos preguntábamos la eficiencia del análisis de plasma para identificar la gastroenteritis por CMV y la bondad de ajuste con las heces, por lo tanto, se realizaron análisis de plasma. El segmento de ADN de CMV en plasma se analizó inmediatamente después de que ocurrieron los síntomas gastrointestinales y el resultado fue negativo. La detección del segmento de ADN de CMV fecal a partir de cfDNA también se realizó dos días después y fue negativa. Los síntomas duraron más de dos semanas y fue necesaria la enteroscopia para el diagnóstico diferencial. La biopsia de enteroscopia y la detección del segmento de ADN de CMV del tejido intestinal respaldaron que se trataba de aGvHD. Después de un mes de tratamiento anti-rechazo inmunológico, tuvo diarrea menos frecuente pero de repente desarrolló sangrado rectal. Tanto la detección de segmentos de ADN de CMV en plasma como en heces fueron positivas, lo que sugiere gastroenteritis por CMV. En consecuencia, el enfoque del tratamiento cambió a la terapia antiviral. Una semana después del tratamiento antiviral, no se pudo detectar el segmento de ADN del CMV en las muestras de plasma, pero aún se mantuvo un alto número de copias en las muestras de heces. Un mes después del tratamiento antiviral, el segmento de ADN de CMV fue negativo tanto en muestras de plasma como de heces. Al mismo tiempo, los síntomas gastrointestinales desaparecieron gradualmente. El segmento de ADN de CMV fue monitoreado y fue negativo durante más de un mes.

Cambios en el número de copias del segmento de ADN del CMV tanto en el plasma como en las heces junto con el tratamiento en dos casos típicos. A El caso muestra que el segmento de ADN de CMV podría ser positivo en heces pero negativo en plasma al mismo tiempo. B El caso muestra que el segmento de ADN de CMV podría ser positivo en plasma pero negativo en heces al mismo tiempo.

El caso 2 (fig. 5B) era una niña de ocho años que padecía anemia aplásica grave durante dos meses antes de recibir la terapia con alo-TPH. Las células madre trasplantadas se implantaron completamente once días después de la infusión de células madre. Casi 3 meses después, aparecieron síntomas de diarrea persistente, con un segmento de ADN de CMV inicialmente negativo tanto en muestras de plasma como de heces. La enteroscopia electrónica mostró congestión difusa y edema en toda la mucosa colónica, y tanto CMV como EBV fueron negativos en la mucosa intestinal. Luego, recibió un tratamiento de inmunosupresión mejorado durante más de 3 semanas antes de la detección positiva del segmento de ADN de CMV en plasma y heces. El tratamiento antiviral duró una semana ya que el segmento de ADN de CMV se volvió negativo en las heces una semana después. Un mes después, el CMV en plasma volvió a ser positivo y permaneció positivo durante más de un mes, mientras que el segmento de ADN del CMV fue negativo en las heces durante todo el período de tiempo. Con tratamiento de inmunosupresión mejorado y tratamiento antiviral, finalmente se recuperó de la diarrea dos meses después.

La terapia con células Alo-HSCT y CAR-T tiene una importancia histórica para las neoplasias malignas hematológicas. Los pacientes que reciben alo-HSCT o terapia con células CAR-T a menudo tienen molestias gastrointestinales, infección o reactivación por CMV y aGvHD, que son complicaciones graves comunes y difíciles de distinguir. Además, estas complicaciones se abordan con tratamientos muy diferentes y, por lo tanto, un diagnóstico incierto trae serios desafíos para el tratamiento. El ensayo tradicional es la biopsia gastrointestinal bajo endoscopia, que es una operación invasiva que potencialmente puede provocar efectos secundarios graves. Se necesitan muestras y métodos de detección alternativos para ayudar a diagnosticar la gastroenteritis por CMV y distinguir otras enfermedades del tracto digestivo.

El uso de cfDNA para predecir o diagnosticar infecciones parece ser superior a las estrategias tradicionales, como los métodos basados ​​en cultivos, con respecto al tiempo de respuesta y la precisión [14, 19, 20]. Los métodos basados ​​en la secuenciación ahora se usan ampliamente en la clínica y permiten la detección de patógenos de amplio rango, pero tienen deficiencias en el sentido de que todavía son un poco costosos y consumen mucho tiempo. Para la detección de patógenos particulares, los métodos basados ​​en PCR tienen ventajas tanto en eficiencia como en sensibilidad. En comparación con el suero y el plasma, las muestras de heces son únicas debido a su fondo bacteriano masivo, así como a los materiales de supresión de PCR. Por lo tanto, los métodos basados ​​en PCR son bastante adecuados para este tipo de muestras porque pueden minimizar la interferencia de otros patógenos.

Un estudio anterior informó que los kits de extracción de ADN tienen un efecto definitivo en la calidad del ADN, especialmente en la composición bacteriana con respecto a la Gram-positividad [21]. Los autores lo atribuyeron a las eficiencias de lisis de bacterias Gram-positivas por diferentes kits de extracción. Al examinar los informes de detección de CMV para el diagnóstico de gastroenteritis por CMV, encontramos opiniones claramente contradictorias sobre el poder diagnóstico de la detección de segmentos de ADN de CMV en muestras de heces. Curiosamente, dos informes que concluyeron que la detección de CMV no era insatisfactoria para el diagnóstico de gastroenteritis por CMV utilizaron el mismo kit de extracción, el QIAamp DNA Stool Mini Kit. Este kit aisló principalmente gDNA de células lisadas en muestras de heces. Sin embargo, si las células epiteliales intestinales no se disociaban demasiado o si no podían mantener una estructura celular intacta antes del procesamiento de las heces, los segmentos de ADN del CMV también estaban ausentes en la extracción de ADN final, incluso si en realidad estaban en las células. Con base en esta suposición, comparamos la extracción de cfDNA y el ADN total de las mismas muestras de heces. Descubrimos que las concentraciones de ADN eran mucho más altas para cfDNA que para el ADN total, y el número de copias del gen de control también era más alto para cfDNA que para el ADN total. Este resultado puede explicarse principalmente por el hecho de que las células epiteliales intestinales se lisaron, apoptósaron o secretaron activamente, liberando cfDNA en las heces con poco desprendimiento de células intactas cuando se produjo la gastroenteritis.

Se informó una comparación entre dPCR y qPCR para la detección cuantitativa de CMV y mostró que qPCR tenía una sensibilidad algo más alta que dPCR [22], lo que puede confundirse con el grado de optimización del enfoque de dPCR. En una publicación reciente de nuestro centro [17], mostramos que los ensayos de dPCR y qPCR tenían buenas correlaciones tanto para los estándares como para las muestras clínicas, pero la dPCR mostró una mejor repetibilidad y reproducibilidad. Más importante aún, el límite de detección del enfoque dPCR fue menor que el de qPCR cuando los dos métodos se optimizaron por completo. Por lo tanto, desarrollamos un procedimiento de detección de segmentos de ADN de CMV basado en dPCR, y la evaluación del rendimiento mostró que tenía una precisión bastante alta en el rango de detección. Teniendo en cuenta la alta especificidad, también probamos la sensibilidad midiendo el LOD50 de los estándares, nuestro LOD50 fue de 3,534 copias/μL (3534 copias/mL). El estudio de Hayden et al. reveló que su LOD era de 4571 copias/mL para los estándares de la OMS [22], estábamos aproximadamente al mismo nivel. Es posible que en el futuro se realice una mayor optimización, como la cantidad de carga de la plantilla de ADN, la concentración de la sonda y los cebadores, y las condiciones de la reacción de PCR.

La infección o reactivación por CMV se ha estudiado ampliamente en pacientes que reciben alo-HSCT, pero carece de datos clínicos suficientes en pacientes que reciben terapia con células CAR-T. Según el leal saber y entender de los autores, este es el primer informe que compara la infección por CMV o la tasa de reactivación en pacientes que reciben alo-TPH y terapia con células CAR-T. Stewart [23] resumió las complicaciones infecciosas de la terapia con células CAR-T y encontró que la reactivación del CMV era poco común incluso en pacientes sin profilaxis. Nuestros datos revelan que la tasa de infección o reactivación por CMV fue similar en los pacientes que recibieron terapia con células CAR-T y en los que recibieron alo-HSCT. La tasa de CMV positivo fue del 30,0 % (3/10) en muestras de pacientes que recibieron terapia con células CAR-T y del 28,6 % (20/70) en muestras de pacientes que recibieron alo-HSCT, respectivamente. Debido a que la selección de pacientes y muestras en nuestro estudio no fue imparcial en el ensayo clínico de células CAR-T, la tasa real de infección o reactivación por CMV debería ser menor en toda la cohorte. Sin embargo, podemos inferir que los síntomas gastrointestinales inducidos por la infección o la reactivación del CMV no fueron raros en los pacientes que recibieron terapia con alo-TPH o con células CAR-T. También evaluamos la relación entre la tasa de infección o reactivación por CMV y el tiempo transcurrido desde que se recibió la terapia con alo-TPH o células CAR-T. Como era de esperar, la tasa de infección o reactivación por CMV no mostró una tendencia clara en el tiempo en pacientes con síntomas gastrointestinales, lo que podría explicarse por el estado inmunosuprimido sostenido.

Para aclarar si las muestras de heces pueden reemplazarse por muestras de plasma para detectar la infección o la reactivación del CMV, comparamos los números de copias del segmento de ADN del CMV en las muestras de heces y los de las muestras de plasma correspondientes recolectadas al mismo tiempo y describimos dos casos especiales en detalle para ilustrar el problema. Descubrimos que los resultados de detección de los dos especímenes no coincidían bien, lo que indicaba que no podían representarse entre sí. Por lo tanto, es necesario analizar muestras de heces en lugar de plasma cuando se sospecha una enfermedad gastrointestinal relacionada con el CMV porque es probable que el plasma sea negativo para la detección del segmento de ADN del CMV. Además, la monitorización de la carga de CMV a partir de muestras de heces mostró ventajas insustituibles en comparación con la biopsia intestinal, que se considera el estándar de oro para el diagnóstico de la enteritis por CMV. En primer lugar, es un método de detección no invasivo que protege a los pacientes de daños adicionales y riesgos de infección. Segundo, es conveniente y económico y permite una detección frecuente y continua para monitorear los cambios de condición. De los dos casos, encontramos que los síntomas gastrointestinales pueden no ser iniciados por la infección o reactivación por CMV, sino que pueden estar acompañados por una infección o reactivación posterior por CMV, lo que siempre complica la condición; por lo tanto, el monitoreo de la carga de CMV es más importante tanto en la clarificación del diagnóstico como en la toma de decisiones médicas.

En conclusión, la detección de CMV por dPCR en cfDNA del sobrenadante de heces es un método poderoso para identificar la gastroenteritis por CMV, que exhibe una mayor eficiencia y sensibilidad y ayuda en la toma de decisiones de tratamiento clínico.

Los datos y materiales están disponibles previa solicitud razonable del autor correspondiente.

Citomegalovirus

Trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas

Enfermedad aguda de injerto contra huésped

ADN libre de células

RCP digitales

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa

ADN genómico

Célula T receptora de antígeno quimérico

Gen de proteína temprano innato 1

Límite de detección a 50

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Agradecemos a todos los participantes por sus contribuciones a este estudio.

Este trabajo fue apoyado por el Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82000189).

Departamento de Hematología, Hospital Tongji, Facultad de Medicina de Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, No. 1095 Jiefang Avenue, Wuhan, 430030, Hubei, China

Jia Gu, Hongyan Ji, Tongyuan Liu, Caixia Chen, Siye Zhao, Yang Cao, Na Wang, Min Xiao, Liting Chen y Haodong Cai

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JG; HJ; TL; CC y SZ realizaron los experimentos y analizaron los datos, JG y HC escribieron el manuscrito, YC y NW cuidaron de los pacientes y proporcionaron información clínica, LC propuso la concepción del trabajo y dirigió la investigación, MX y HC supervisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Haodong Cai.

Los estudios con participantes humanos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Ética del Hospital Tongji, Facultad de Medicina de Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong (TJ-IRB20180809).

Todos los autores aprobaron el manuscrito para su publicación.

Los autores no declararon ningún conflicto de interés.

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Los detalles de la validación del ensayo y el análisis de datos sobre las cifras de este estudio.

Ejemplos de resultados experimentales positivos y negativos.

La correlación entre la concentración de ADN de entrada (cfDNA) y el número de copias del gen de referencia POP4.

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Reimpresiones y permisos

Gu, J., Ji, H., Liu, T. et al. Detección de citomegalovirus (CMV) por PCR digital en muestras de heces para el diagnóstico no invasivo de gastroenteritis por CMV. Virol J 19, 183 (2022). https://doi.org/10.1186/s12985-022-01913-z

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Recibido: 16 julio 2022

Aceptado: 01 noviembre 2022

Publicado: 11 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-022-01913-z

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